Hoofd Menu

Monografie voor analyse cannabis kwaliteitscontrole

In een van de achttien aanbestedingsdocumenten behorende bij de nieuwe tender voor medicinale cannabis productie van farmaceutische en constante kwaliteit die 12 juli 2019 werd gepubliceerd staat ook de monografie van Farmalyse BV voor de chemische analyse van cannabis kwaliteitscontrole aangegeven. Deze is gedateerd op 28-11-2014 en lijkt toegeschreven naar de varieteiten van Bedrocan, die vooralsnog als enige medicinale cannabis levert aan het Bureau voor Medicinale Cannabis (BMC) van het Ministerie van VWS. Het kabinet is echter voornemens 'het aantal telers van medicinale cannabis te verdubbelen' (onder 6). Feitelijk zou hier de expliciete term 'farmaceutische cannabis' gesproken moeten worden, aangezien velen ook zelf cannabis kweken in het kader van zelfzorg voor medicinaal/therapeutisch gebruik.

Opmerkelijk is dat er wel cannabinoiden en cannabinoid-zuren staan vermeldt bij dit testprotocol die als soort van blauwdruk voor het testen van cannabis kan worden gezien, maar echter geen terpenen, dat zijn de geurstoffen van cannabis die de karakteristieke geur geeft, terwijl deze geurstoffen net als in mindere mate de flavinoiden voor de werkzaamheid en smaakbeleving van cannabis wel belangrijk zijn. Hierover heeft Ethan Russo al in 2011 gebupliceerd in diens gezaghebbende artikel 'Taming THC, potential cannabinoid synergy and phytocannabinoid and terpenoid entourage effects'.

Deze genoemde monografie wordt hieronder in het engels weergegeven en is vermeldenswaardig omdat in het kader van het experiment met een gesloten coffeeshopketen er ook cannabis soorten zullen worden getest. Uit de adviesrapportage van de adviescommissie Knottnerus 20-06-2018 staat dat voor het testen van cannabis binnen het wietexperiment minder strikte normen gehanteerd zouden hoeven worden dan voor medicinale cannabis. Citaat p.20: 'Bij niet-medisch gebruik acht de commissie het niet bezwaarlijk om bij de bepaling van het THC en CBD-gehalte van de verschillende cannabisvariëteiten iets minder strikte marges te hanteren'

Daarbij is het dus interessant om de normen voor het testen van medicinale cannabis via UHPLC - ultra high performance liquid chromatography - de koude testmethode die ook plantzuren vast kan stellen - nader te bekijken om die te vergelijken met hoe dat nadien in de Ministriele regeling vermeld zal gaan worden bij de 'experiment-cannabis' van de landelijke wietproef, mogelijk dat GC, gaschromatografie - de hete testmethode die vanwege decarboxilatie geen planttzuren kan detecteren - ook zou kunnen volstaan. Tevens of deze monografie die naar Bedrocan toegeschreven lijkt wel of niet werkbaar is voor een tweede kandidaad om farmaceutische cannabis aan apotheken te leveren. Een protocol om accuraat cannabis producten te testen luistert nogal nauw, als dat niet onder dezelfde condities plaatsvind kunnen er testverschillen ontstaan waardoor de vraag naar de betrouwaarheid van de testresultaten naar voren komt.in dit geval gaat het over cannabis flos, dus gedroogde cannabistoppen van vrouwelijke cannabisplanten. Of en hoe eadibles, hars en olie binnen het experiment worden getest zal nog moeten blijken en dat zal ook weer steeds een andere aanpak bij het opmaken en testen van samples vergen. in paragraaf 5.4.2 van de UNODC 2009 publicatie over het opmaken van testsamples staan verschillende voorbeelden aangegeven. Voor CBD producten als voedingssupplement gelden andere richtlijnen en ook blijken niet alle labs alle testparameters te kunnen testen (zie p4 van 4) Een andere complicatie voor een valide kwaliteitscontrole n.a.v ringtesten blijkt dat lang niet alle testlocaties bij eenzelfde homogeen sample dezelfde resultaten laten zien, dus bij welk laboratorium kan je dan het beste terecht? Zie voorbeeld 'How accurate is potency testing?' uit 2011 van Hazekamp & Gieringer.

De vraag is dus hoe valide en betrouwbaar zullen de richtlijnen voor de kwaliteitscontrole voor cannabis tijdens het landelijke wietexperiment uiteindelijk zijn? Aangewezen telers kunnen samples bij een laboratorium met een opiumontheffing laten testen, hoe een representatieve bemonstering per soortje daarbij gaat verlopen, wat de test frequentie zal zijn, wat de testkosten zullen worden (die aan de consument wordt doorberekend) en wat de doorlooptijden van de rapportage is eer de producten vrijgegeven kunnen worden voor de gedoogde verkoop is vooralsnog allemaal onbekend. Zie ook al een eerdere reflectie nav de concpect AMvB op de cannabiskieswijzer. 

This monograph describes the release testing of Cannabis Flos (flowers / granulated), specifically the varieties: Bedrocan, Bedrobinol, Bediol, Bedica, Bedrolite and Bedropuur.

The test parameters are:
1. Appearance
2. Foreign Material
3. Fineness
4. Identification A: Microscopic Properties
5. Identification B: TLC
6. Microbiological Contamination
7. Aflatoxins
8. Pesticides
9. Heavy Metals
10. Loss On Drying
11. Assay and Related Substances Sampie Preparation

The ungrinded sample will be used for test numbers 1, 2, 3, 6 and 7 (except if the sample material is already in granulated form). The remaining sample will be grinded using a simple kitchen blender until the material is about 5 mm in diameter, homogenised and subsequently used for the remaining tests. Please note that that the LOD test has to be carried out on the same day as the samples for the test Assay and Related Substances are prepared.

List of Abbreviations
Delta 9-THC: Delta 9-Tetrahydrocannabinol
Delta 8-THC: Delta 8-Tetrahydrocannabinol
THCA: Tetrahydrocannabinol Acid
CBD: Cannabidiol
CBDA: Cannabidiol Acid
CBG: Cannabigerol
CBN: Cannabinol
cm: centimeter
EP: European Pharmacopoeia
ICP-OES: Inductively Coupled Plasma — Optical Emission Spectroscopy
LLOQ: Lower Limit Of Quantitation
LOD: Loss On Drying
mg: milligram
min.: minute(s)
mL: milliliter
mm: millimeter microliter
NLT: Not Less Than
NMT: Not More Than
PTFE: Poly Tetra Fluoro Ethylene
RF: Response Factor
rpm: rotations per minute
RRT: Relative Retention Time
RSD: Relative Standard Deviation
S/N: Signal-to-Noise ratio
SST: System Suitability Test
TAMC: Total Aerobic Microbial Count
TYMC: Total Yeast and Molds Count
TBA: 2-t-Butyl-Anthraquinone
TLC: Thin Layer Chromatography
vlv: volume / volume

1. Appearance
Bedrocan, Bedrobinol, Bedropuur: Brown green clustered flowers of 1.5 to 3 cm length with a characteristic smell.
Bediol, Bedica and Bedrolite: Brown green granulate of the flowers (about 5 mm) having a characteristic smell.

2. Foreign Material
Bedrocan, Bedrobinol, Bedropuur: The sample material is free from staiks, insects and other vermin.
Bediol, Bedica and Bedrolite: The sample material is free from insects and other vermin.

3. Fineness
Bedrocan, Bedrobinol, Bedropuur: Macroscopic inspection of the ungrinded material does not show leaves shooting out more than 20% of the length of the flowers. Moreover, the staiks are cut away directly under the bottom flowers of the inflorescence.
Bediol, Bedica and Bedrolite: Stalks are not longer than 2.0 cm and only 20% of the staiks is between 1.5 and 2.0 cm.

4. ldentification A: Microscopic Properties
4.1 Reagents Chloral hydrate solution: A solution of 80 grams Chloral hydrate in 20 mL Demi water.
4.2 Execution Prepare a Chioral hydrate preparation by adding a few drops of the Chioral hydrate solution to a spatula tip of plant material and shortly cooking it on a littie flame. Under the microscope gland hairs are mainly observed.

5. Identification B: TLC
5.1 Reagents
Petroleum ether (40-60 fraction)
Diethyl ether
East Blue B Salt (stabilised with Zinc chloride);
CAS number: 14263-94-6
Ethanol (absolute)
Methanol Bedrocan reference extract
Bedrobinol reference extract
Bediol reference extract
Bedica reference extract
Bedrolite reference extract
Bedropuur reference extract
5.2 Execution 
TLC-plate: Silicagel F254 (Merck art. nr. 5715) Eluent: Petroleum ether: Diethyl ether = 40: 10 (v/v). Saturate the TLC chamber. Travel distance of solvent front: 10 cm. Spray agent: A solution of 1 gram East Blue B Salt in a mixture of 50% Ethanol in Demi water. System Suitability Use the Bediol reference extract for the SST. The red coloured spot (THCA) and the orange coloured spot (CBDA) must be well separated. 

Analysis Sample solution A: Use Sample solution 1A from the test “Assay and Related Substances” (see Section 11).
Standard solution A: Use the reference extract that matches the variety to be analysed in the test “Assay and Related Substances” (see Section 11).
Apply 10 pL of the sample solution and standard solution to the TLC plaat in a round spot of max. 5 mm width. Do not apply at once, but dry in between. Place the plate in the TLC chamber containing eluent and let the solvent front develop about 10 cm. Dry the plate in the air, apply spraying agent and 1f necessary warm the plate with a laboratory heater to enhance the visibility of the spots. Observe the plate in normal light.

Assessment of the plate Bedrocan, Bedrobinol, Bedica and Bedropuur: The main spot in Sample solution A is coloured red (THCA) and has an RF value and intensity equal to those of the corresponding reference extract. The chromatogram of Sample solution A may show a red-violet zone corresponding to t9-THC.
Bedrolite: The main spot in Sample solution A is coloured orange (CBDA) and has an AF value and intensity equal to those of the corresponding reference extract.
Bediol: In addition to the spots mentioned before, an orange coloured spot is observed corresponding with the spot from the reference extract of Bed iol (CBDA).

6. Microbiological Contamination
These tests are executed on 10 grams ungrinded material. The material that has not undergone germ reducing treatment is tested for: - TAMC - TYMC - Total combined count (TAMC + TYMC)
- Enterobacteriaceae and gram negative bacteria
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus

7. Aflatoxins
This test is executed on 5.0 grams ungrinded material. The analysis is according to the current EP monograph “Determination of aflatoxins B1,B2,G1 and G2 in herbal drugs (2.8.18)”. The specification is NMT 4 ig per kg.

8. Pesticides
Pesticides are tested according to EP monograph 2.8.13. It should be noted that not all EP Pesticides are being analysed with the GC-MS method. For that reason the following text is added to the CoA: “The following components are not being analysed with the current method: Bromide inorganic, Dithiocarbamates, Fenchiorophos, Methacriphos, S-421”.

9. Heavy metals
This test is executed on 5 grams grinded material using different atomic absorption and emission techniques.
Lead: max. 20.0 ppm (ICP-OES)
Cadmium: max. 0.5 ppm (ICP-OES)
Mercury: max. 0.5 ppm (Combustion
Atomic Absorption) Arsenic: Indicative (ICP-OES)
Nickel: Indicative (ICP-OES) Zinc: Indicative (ICP-OES)

10. Loss on drying
This test is executed on 0.500 gram of the grinded sample material using EP monograph 2.3.32 method C. It is heated during 24 hours at 40°C above Phosphorous Pentoxide under vacuum. The specification is: NMT 10.0%.

11. Assay and Related Substances
11.1 Reagents Ethanol (absolute) Acetonitrile Formic Acid Milli-Q Water
11.2 Equipment UPLC-column: Waters Aquity Cl 8, 1.7 im, 2.1 x 150 mm
Column temperature: 30 °C
Tray temperature: 8 °C
Mobile phase: 0.1 %
Formic Acid in Acetonitrile (A) 0.1 %
Formic Acid in Milli-Q Water (B) Solvent / Needie wash: A: B = 70 : 30 (v/v)
Centrifuge: Eppendorf, Model 5810 (or equivalent)
11.3 Execution
Sample Solutions (fresh material) Weigh 1000 mg of the grinded sample material in a “Falcon tube” and shake (ca. 300 rpm) during 15 minutes with 40 mL Ethanol and centrifuge (3000 rpm). Transfer the dear upper layer into a 100 mL volumetric flask. Repeat this step two times with 25 mL Ethanol and make up the solution to the mark with Ethanol. Filter the Sample solution over a 0.45 pm PTFE filter. Pipet 1 .0 mL of the filtrate in a volumetric flask of 10 mL and make up to volume with Solvent (Sample Solutions 1A Ml and 1A M2). Dilute Sample Solution 1A a factor 10 with Solvent (Sample Solutions 1B Ml and 1B M2). Standard Solutions Weigh accurately about 50 mg TBA standard in a volumetric flask of 100 mL, add 25 mL Solvent and dissolve. Make up to volume with Solvent. Dilute 1.0 mL to 50.0 mL with Solvent (Si +S2; 0.01 mg / mL). LLOQ Solution Dilute the Standard Solution TBA with a concentration of 0.01 mg / mL to a concentration of 0.002 mg / mL by pipetting 5.0 mL of the Standard Solution TBA in a volumetric flask of 25.0 mL and make up to volume with Solvent.
Resolution Solution Make a mixture containing 9-THC and 8-THC, wherein the ratio of i9-THC / 8-THC should be 0.04 mg /mL and 0.0025 mg / mL respectively. This solution can be prepared for instance by the following method. Dilute 200 pL 9-THC Stock Standard Solution (i.e. 2 mg / mL 9-THC in Ethanol) and 1000 IIL Ê8-THC Stock Standard Solution (i.e. 0.025 mg / mL i8-THC in Ethanol) in a volumetric flask of 10 mL and make up to volume with Solvent.
Reference Extract Solution It should be noted that each variety has its own reference extract. Prepare a dilution (factor 5) from the reference extract by pipetting 50 tiL of the reference extract (corresponding to the sample) in a vial with insert and dilute with 200 iL Solvent. Injection Sequence Prepare by injection sequence
11.4 System Suitability Test 
- The RSD of 6 replicate injections of Standard Solution Si (peak area TBA) is 2.0%; 
- Standard Solution S2 has a Recovery of 98.0% to 102.0% when calculated against Standard Solution Si; 
- The Resolution between the peaks of 9-THC en 8-THC in de Resolution Solution should be - The TBA peak in the LLOQ Solution has a S/N value of 10; 
- The chromatographic profile of Sample Solution 1 A must resemble that of the corresponding Reference Extract.
11.5 Calculation Assay THCA (and CBDA in Bediol and Bedrolite) Sample solutions 1 B Ml and 1 B M2 are used to calculate the total content of THCA on dried sample material. When testing the varieties Bediol and Bedrolite, also the total content of CBDA has to be calculated.


                                     Am x Vm x Ws x Vf          x          100 
THCA(%) = lOO x        Rf x As x Vs x Wm                  (100—LOD) 

THC total equivalents (%)=%THCA x 0.877 + %THC


In which:
Am1B: Area of Sample (for Assay)
Am1: Area of Sample (for Related Substances)
Vm: Volume of Sample (mL) 
Ws: Weight of TBA reference standard (mg)
AF: Response Factor against TBA
As: Area of TBA reference standard
Vs: Volume of TBA reference standard (mL)
Wm: Weight of Sample (mg)
Vf: Dilution factor (10 or 100)
LOD: Loss On Drying (see Section 10)
0.877: Factor for the conversion of the Molecular Weights

11.6 Calculation of Related Substances
Calculate the Related Substances (total equivalents) from Sample Solution 1A Ml and 1A M2 on dried basis using the example calculation shown above. Concentrations less than 0.05% shail be reported as NMT 0.05%.

12. Literature
1. Monograph “BMC/Farmalyse ter vrijgiftecontrole van Cannabis Flos (Hennepbloemen); variëteiten Bedrocan, Bedrobinol en Bediol; versie 7.0.” (in Dutch).
2. EP 01/2012:1433 Herbal drugs; for the tests LOD and Heavy Metals.
3. “Validatie gehaltebepaling m.b.v. UPLC uitgevoerd door Farmalyse” (rapport UPLC-0512-1); in Dutch.
4. “Pesticiden: Validatie uitgevoerd door TNO Voeding met als referentie ASC-2004/0941 revi - mol.”; in Dutch.
5. Validation of the analytical method for the determination of the Cannabis Flos variety Bedica and the determination of the response factors of the cannabinoids Ê9-THC, CBD, CBN, THCA, CBDA and CBNA. VWS 2012-013 version 2. April 18, 2013.
6. Determination of the Cannabis Flos varieties Bedrocan and Bedica on the Thermo (U)HPLC at Farmalyse B.V. VWS, September 2013.